mRNA降解机制参与学习记忆与社会交流行为等神经功能

 公司新闻     |      2019-10-17 21:27

  已知的自闭症、智能障碍等神经发育疾病的发病病因极具多样性,其中包括基因风险因子如CNTNAP2, CASPR2, FOXP1/2等【1-4】,外因造成的大脑结构损伤,或先天/后天接触的环境因素等,但仍有一大部分患者无法被诊断出具体致病病因,这阻碍了治疗方法的发现。贝勒医学院Costa-Mattioli实验室及其合作者通过诊断无义介导的mRNA降解机制(Nonsense-mediateddecay, 凯发k8登陆NMD)关键基因突变携带患者,研究果蝇、小鼠模型,发现了一个新的致病通路,并找到了两种潜在治疗药物,为神经发育疾病病因及治疗手段的研究提供了新思路。

  2019年10月1日,贝勒医学院Costa-Mattioli实验室的Jennifer Johnson, Lorenada Stoica和Yuwei Liu等人在Neuron杂志发表了题为Inhibition of Upf2-Dependent Nonsense-MediatedDecay Leads to Behavioral and Neurophysiological Abnormalities by Activatingthe Immune Response的研究。这项工作揭示了一个非常广泛的质检机制——NMD参与神经系统中的重要作用。该机制的功能失调在小鼠模型中引起了大量的神经炎症反应,并造成记忆、神经可塑性、社会交流及语言交流问题,并且,他们找到了两种FDA批准在人体中使用的药物可降低炎症水平并恢复小鼠模型中学习记忆、社会交流及语言等行为学缺陷。

  背景

  信使RNA(MessengerRNA, mRNA)被翻译成蛋白质的过程是分子生物学中央法则中的至关重要的一部分。已知的mRNA质检机制包括No-go降解(No-go decay, NGD), Nonstop降解(Nonstop decay, NSD)和NMD。其中,NMD是一个存在于所有真核生物中的遗传纠错机制,其广泛的演化保守性体现了这一机制的重要生物学意义。NMD机制通过扫描mRNA,检测无义突变造成的提前终止密码子(Prematuretermination codon, PTC),并降解携带PTC的mRNA。如果这些异常mRNA未被有效降解,其翻译有可能翻译出有害的截断蛋白。体细胞突变、转录或RNA剪切期间产生的错误都将造成早熟终止子的产生。

  简单来说,整个过程包括检测并发现PTC,对含有PTC的mRNA的标记,及对其的降解。值得注意的是,NMD机制不仅仅针对异常转录子,研究发现,它也参与调控正常生理功能【5,6】。在不同物种间,保守的3个NMD因子包括Upf1、Upf2和Upf3(包含Upf3a和Upf3b) 【7】。其中,Upf2参与PTC的检测过程,因此,Upf2功能失活将完全阻碍NMD机制的发生。对该机制详细介导机理感兴趣的读者可以参照引用文献进行细读【8】。另外,异常转录子的检出发生在蛋白质翻译期间,因此,如果蛋白质翻译过程受损,NMD机制的活性也将随即受损【9】。作者在文章讨论部分对NMD与蛋白质翻译在学习记忆中的角色也进行了探讨。

  在此之前,有不少研究报道NMD关键因子UPF3B的失活突变及UPF2的拷贝数目变异【10,11】在人体内导致神经发育疾病的相关报道。本研究首次发现了携带UPF2致病突变的患者,并诊断病人有NDD症状,呈现语言交流障碍,该症状得以在NMD失调的小鼠模型中重复。在该小鼠模型中,Upf2引起的NMD失调引起了严重的神经炎症,而抑制炎症的药物恢复了大部分行为学缺陷。另外,该研究还讨论了蛋白质合成及mRNA转录质检过程参与学习记忆机制的可能性,给学习记忆研究领域带来了新视角。

  主要结果

  1、UPF2致病突变携带患者体内的NMD功能失调,病人均有语言功能障碍

  Costa-mattioli组的合作者在英国与澳大利亚发现并诊断了三个来自独立家庭的患者,三为患者均携带UPF2基因的致病突变(其中案例1和案例2为frameshift突变,案例3携带UPF2的删除突变)。该三名患者的共同症状突出为智能障碍及语言功能障碍,其中包括表述、阅读和拼写等交流功能障碍,诊断描述见下表。

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  (A) Summary of clinical phenotypes in affectedindividuals with UPF2 variants. R, right; AVSD, atrioventricular septal defect;ASD, autism spectrum disorder; N, not present; Y, present; avg, average; ext,extremely; artic, articulation disorder; mod, moderate; NA, not availablebecause the child has severe ID and is non-verbal.

  研究者通过对病人提取的淋巴细胞细胞系DNA测序结果与先前报道的UPF3B病人和UPF2拷贝数目变异病人的序列【10, 12, 13】进行相关性分析,发现这些病人与UPF3B的基因变化非常相关,并且这三个病人序列之间都呈现较高的相互相关性(如下图),这提示NMD在该三名患者体内均功能失调。(注意,UPF3B在X染色体上表达,所以本研究所引用的UPF3B致病突变男性患者为先天性NMD因子UPF3B knockout,因此,其基因数据是一个非常具有代表性的NMD失调的基因序列组。)

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  因此,作者认为,UPF2致病突变导致患者NMD功能失调,并造成了语言交流障碍等症状。

  2、NMD失调的果蝇和小鼠均呈现长期记忆形成缺陷表型,小鼠呈现社会行为障碍及突出可塑性失调

  接下来,作者在果蝇和小鼠中模型Upf2的致病突变。由于现未有已知的有效抑制NMD的药物,作者选择用操控基因来构建模型。在果蝇中,作者敲除了Upf2。而在小鼠中,Upf1或Upf2全敲除都会造成胚胎致死;另外,虽然病人携带的UPF2致病突变只存在在一条染色体上,为突变杂合体,但在小鼠中,Upf2突变杂合体(Upf2+/-)行为学上并无异常。于是,作者选择用CamKII-Cre选择性地在前脑excitatory兴奋性神经元中敲除Upf2基因(下文将用Upf2 fb-KO小鼠代称该模型)。

  作者在果蝇和小鼠中均进行了检测长期记忆形成的行为学实验,均发现长期记忆形成过程被损害。在小鼠中,作者还对神经元的生理学活性进行了检测,用其突出可塑性损伤解释了其行为学表型。除此之外,作者还检测了小鼠的社会行为和固有行为进行了检测,发现小鼠具有孤独症相关行为表现。其中,令人惊讶的一个表型为小鼠的超声波发生行为(Ultrasonic Vocalization, USV)在野生型和Upf2 fb-KO小鼠中差异显著。如下图a展示,小鼠的发声频率较野生型小鼠显著低,并且其声波种类构成也是天差地别(下图c&d,发声种类参照下图b)。虽然作者并未对声波种类的改变做出任何功能性的解释,但低发声频率及高长音节的组成与患者的语言沟通障碍表型非常一致,即构音异常,音节拖长等。

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  3、Minocycline和Cyclophosphamide能够降低神经炎症并部分治愈行为学表型

  接着,作者通过RNA测序,发现Upf2 fb-KO小鼠中有大量与免疫系统通路相关的基因上调,如下图。有趣的是,该现象也在植物中被发现【14, 15】,NMD功能失活的拟南芥生长异常,并表现极强的自免疫,更难被病毒侵染。

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  于是,作者进而用流式细胞侦测实验检测小鼠大脑中的细胞组成,发现Upf2 fb-KO小鼠脑内免疫细胞显著增加,包括T细胞、B细胞和中性粒细胞。值得注意的是,该免疫反应具有特异局部性,因为在Upf2 fb-KO小鼠的脾脏中,免疫细胞数量与野生型小鼠基本一致。根据这些结果,作者假设是机体的免疫系统开始攻击机体正常神经细胞,导致所观察到的种种行为学缺陷。于是他们尝试使用Cyclophosphamide (CyP)这一免疫抑制剂对2月龄的Upf2 fb-KO小鼠(注意,此时动物还未产生行为学缺陷)进行预防性治疗。由于CyP强力的免疫活性抑制能力,该药物被广泛使用于癌症、自体免疫疾病的治疗【16】。结果显示,CyP的预处理成功避免了大部分行为学缺陷,包括长期记忆的形成、社会行为及突出可塑性强度等。

  除了后天免疫系统的参与,作者还在Upf2fb-KO的小鼠中发现脑内固有免疫细胞的激活反应。如图所示,Upf2 fb-KO小鼠脑内有大量的星形胶质细胞及小胶质细胞激活。因此,作者又用了另一种已知可抑制小胶质细胞活性的药物Minocycline (Mino)对小鼠进行治疗。如图,CyP和Mino均缓解了Upf2 fb-KO小鼠脑内的炎症反应。

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  作者发现与CyP预处理结果相似,Mino也成功地恢复了小鼠的长期记忆形成障碍及社会行为障碍。值得注意的是,这两种药物都成功将Upf2 fb-KO小鼠的USV发声组成恢复到了野生型控制组小鼠水平,如下图所示。

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  到此为止的发现似乎并不出人意料——理论上来说,NMD失调后,含有PTC的mRNA将会被翻译成截断蛋白,成为机体内从未有过的新抗原,因此形成了严重的炎症反应,导致释放这些“抗原”的神经元被攻击。虽然这一假设仍未被实验证实,但从逻辑推理来说似乎合情合理。那么这里遗留的问题之一则是,到底是哪种免疫细胞主导的这一NMD失活下游的炎症反应呢?显然,这两个药物并不够特异,但作者曾尝试通过从Upf2 fb-KO小鼠中分别敲除T细胞和B细胞,从而检验是否后天性免疫系统是造成行为学障碍的罪魁祸首这一假设,但均无缓解作用,说明后天免疫系统并不是该神经炎症的罪魁祸首。中性粒细胞及大脑固有免疫细胞星形胶质细胞、小胶质细胞在NMD介导的炎症反应中的作用还有待检验。

  总而言之,该研究首次发现了UPF2失活突变造成病人的语言障碍,提示Upf2可能作为一个新的语言基因,并强调上调的免疫活动可能是Upf2失活介导的神经功能失调的罪魁祸首。研究中发现的Minocycline和Cyclophosphamide都为美国食品药物监督管理局批准使用在人体中的药物,所用的起效剂量也是通常不会产生副作用的低剂量,本研究的结果表明这两种药物有很大的潜力能成为文中发现的这些病人的治疗药物。

  遗留问题讨论

  本研究提示NMD可能在学习记忆过程中扮演重要的角色,那么在其他学习记忆功能受损的生理过程中,如阿尔兹海默症或正常衰老过程中,NMD的活性是否也有致病性的变化?正如前文提到,NMD伴随着蛋白质翻译的过程发生,而衰老过程中,蛋白质翻译活性会自然降低或因病变而降低,是否可以用NMD来解释衰老过程或其他蛋白质翻译过程异常的疾病呢?已有不少研究表明肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)动物模型中NMD功能异常,且增强NMD关键因子Upf1成功在果蝇模型中改善运动缺陷【17,18】。

  此外,本研究结果的亮点之一在于,作者的实验结果提示Upf2有可能作为Foxp2类似的一个新的语言基因(“语言”基因到底存不存在? -Cell挑战“教科书”式发现),这一点的确定还需要更多患者的发现和诊断。

  NMD引起神经炎症的机制是什么?是否有可能是由未被降解的携带PTC的mRNA翻译而来的截断肽段引起了神经炎症反应?又是什么免疫细胞作为罪魁祸首?细心的读者应该已经发现本研究只建立并研究了NMD在部分神经元中功能失活的模型,那么NMD在抑制性神经元中是否也扮演类似的角色呢?另外,究竟哪些mRNA是NMD的直接靶点?这些问题的回答将进一步加强我们对NMD如果参与正常神经功能的了解,并将促进相关临床治疗方法的发现。希望本文解读和这篇研究发现能够作为点燃相关领域学者对NMD这一通路的兴趣和新思路的火苗。

  原文链接:

  https://www.cell.com/neuron/pdfExtended/S0896-6273(19)30733-0